2020年初新冠疫情爆發(fā)，12月份Pfizer/BioNTech和Moderna開(kāi)發(fā)的新guan疫苗就都獲得了FDA緊急使用授quan。mRNA新guan疫苗開(kāi)發(fā)速度之快，讓行業(yè)認(rèn)識(shí)到mRNA及包裹mRNA的脂質(zhì)納米顆粒（Lipid Nanoparticle，LNP）技術(shù)在疫苗和藥物開(kāi)發(fā)上的可行性和優(yōu)勢(shì)。mRNA是帶有負(fù)電荷的長(zhǎng)鏈大分子，與細(xì)胞膜靜電排斥使其很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。并且mRNA分子是單鏈，極其脆弱，體內(nèi)的多種酶都能將它迅速降解，很難將其遞送至細(xì)胞內(nèi)編碼蛋白。LNP可以將mRNA包裹在核中以避免降解，其中含有的可電離的陽(yáng)離子脂質(zhì)、中性輔助磷脂、膽固醇和PEG化脂質(zhì)“各有分工"（圖1），幫助mRNA實(shí)現(xiàn)有效包載和細(xì)胞遞送。微流控技術(shù)可以控制參數(shù)和脂質(zhì)組成來(lái)控制粒徑及粒徑分布，不需要額外的整粒步驟，適合mRNA或者其他有穩(wěn)定性要求的藥物納米結(jié)構(gòu)的制備。

圖1  LNP組分功能

微流控技術(shù)是一種利用微通道處理或操縱微小流體的技術(shù)，所用裝置又稱為微流控芯片，具有體積輕、反應(yīng)速度快、能耗低、樣品及試劑用量少的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。

微流控的流體特性

雷諾系數(shù)(Reynolds number，Re)用于衡量作用于流體上的慣性力與黏性力相對(duì)大小。Re大意味著慣性力占主要地位，流體呈湍流，在一般管道Re<2000為層流狀態(tài)（圖2）。微流控中的流體Re通常遠(yuǎn)小于100，屬于典型的層流，黏性力的影響遠(yuǎn)大于慣性力，同時(shí)由于流動(dòng)阻力大，液體間不易混合。對(duì)于不互溶液體，在層流狀態(tài)下擴(kuò)散更難以形成，兩相界面明顯(圖3a)；而互溶液體在此層流狀態(tài)下也會(huì)形成界面，不同液體間的擴(kuò)散隨著時(shí)間的延長(zhǎng)沿橫向／縱向進(jìn)行(圖3b)。隨著混合液體的特性、通道結(jié)構(gòu)尺寸等多種因素的變化，微流控管道中的流體會(huì)形成塞狀流、分層流、液滴流和環(huán)形流等多種不同的流型。由于在微流控通道內(nèi)流體通過(guò)的體積極小，借助驅(qū)動(dòng)裝置可以精準(zhǔn)調(diào)控液體流量和流速。互溶液體間可通過(guò)對(duì)流體的控制和加劇混合來(lái)迅速得到大小均一、重復(fù)性好的粒子：不互溶液體間通過(guò)在混合過(guò)程中界面保留及邊界流體對(duì)中間流體的剪切得到均一的單乳／復(fù)乳液滴結(jié)構(gòu)等。

圖2  湍流和層流示意圖

圖3  不同微流體混合界面示意圖

a：不互溶流體界面；b：互溶流體界面

微流控的通道結(jié)構(gòu)

微流控通道的結(jié)構(gòu)（尺寸、通道形狀和壁面等）會(huì)對(duì)流體狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響。zui常見(jiàn)的通道為平直結(jié)構(gòu)(圖4a)，為增強(qiáng)流體的有效混合，會(huì)將通道進(jìn)一步設(shè)計(jì)成多種結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)通道不同結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)，更有利于液體在通道的彎折、起伏結(jié)構(gòu)中在較低Re情況下產(chǎn)生劇烈的渦旋攪拌作用而增強(qiáng)混合效果，減少混合時(shí)間。

圖4  微流體芯片的不同通道結(jié)構(gòu)示意圖

微流控的粒徑影響因素

通過(guò)調(diào)節(jié)微流控參數(shù)和脂質(zhì)組成可以控制形成的LNP粒徑。I.V. Zhigaltsev等采用圖5所示微流控結(jié)構(gòu)，保持脂相流速為0.5mL/min，水相流速?gòu)?.5mL/min升至4.5mL/min來(lái)調(diào)節(jié)水脂相流速比（flow rate ratio, FRR）為1-9，此時(shí)總流體流速（total flow rate, TFR）從1mL/min增加至5mL/min。從圖5可以看出，隨著FRR增大，混合更快且稀釋效應(yīng)更好，粒徑減小。脂質(zhì)為POPC時(shí)，最小粒徑約20nm；脂質(zhì)為POPC/Chol時(shí)，最小粒徑略有增加，為40nm。從中可以看出改變脂質(zhì)相，LNP的粒徑改變，且膽固醇可以增加LNP的最小粒徑。

此外其他研究表明微流控芯片通道尺寸、深度以及幾何形狀對(duì)制備的脂質(zhì)體大小沒(méi)有顯著影響，不同的芯片結(jié)構(gòu)、通道尺寸都可以產(chǎn)生尺寸相似的脂質(zhì)體。但通道尺寸和深度較大的芯片易于制作和操控，且制備通量更高，有利于實(shí)際應(yīng)用。

圖5  微流體結(jié)構(gòu)示意圖及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 Ignite^TM微流控混合儀

Ignite^TM是PNI（Precision NanoSystems）的Nanoassemblr®平臺(tái)在2019年推出的微流控混合儀，適用于LNP、脂質(zhì)體、乳劑等納米結(jié)構(gòu)的制備，可以實(shí)現(xiàn)納米顆粒組分在納升水平（<20nL）以毫秒（＜3ms）混合，保證混合效果。同時(shí)PNI推出一系列適用于不同藥物開(kāi)發(fā)階段的微流控混合儀（圖6），覆蓋藥物研發(fā)各階段的制備需求。Ignite單次制備時(shí)間很短（分鐘級(jí)），一天可以篩選30+種處方，非常適合用于處方的快速篩選。但是Ignite儀器昂貴，購(gòu)買(mǎi)成本高且需要時(shí)間，這時(shí)儀器租賃就成為不錯(cuò)的選擇。北京大學(xué)生命科學(xué)華東產(chǎn)業(yè)研究院聯(lián)合輔必成及艾偉拓共同打造了“微納米注射劑中試基地"不僅提供Ignite儀器租賃，還可以提供LNP制備輔料（合成磷脂和陽(yáng)離子脂質(zhì)）、LNP知識(shí)培訓(xùn)、儀器使用指導(dǎo)及現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試、現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)指導(dǎo)等方面的服務(wù)，歡迎各位蒞臨參觀、指導(dǎo)和業(yè)務(wù)洽談。基地地址：江蘇省啟東市世紀(jì)大道2099號(hào)。

圖6  PNI不同規(guī)模微流控混合儀及Ignite詳細(xì)介紹

圖7 微納米中試基地

注釋：學(xué)海無(wú)涯，個(gè)人學(xué)識(shí)有限，如果有錯(cuò)誤之處，歡迎各位批評(píng)指正。

參考資料：

1. mRNA療法的遞送系統(tǒng)匯總

2. 微流控芯片技術(shù)在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展研究 余逸，陳子郁，于麗麗

3. 微流控技術(shù)在納米藥物輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用 郭希穎，魏 巍 ，王堅(jiān)成+，張 強(qiáng)

4. Microfluidic-mediated nano-drug delivery systems: from fundamentals to fabrication for advanced therapeutic applications

5. Bottom-Up Design and Synthesis of Limit Size Lipid Nanoparticle Systems with Aqueous and Triglyceride Cores Using Millisecond Microfluidic Mixing

6. FluidicLab流體實(shí)驗(yàn)室-應(yīng)用微流控技術(shù)生成載藥型脂質(zhì)體